在线拉曼作为PAT体系的重要工具，凭借其非侵入、无需样品制备、同时检测多种物质以及即时获取检测数据的独特优势，正在重塑生物制药的过程控制模式。

在线拉曼通过实时捕捉反应器中底物、产物、细胞代谢物等目标物质的光谱信号，通过分析模型将其转换为可供直接决策的生化参数。这种实时洞察能力，使工艺开发人员能够将传统的“离线检测”转变为“过程动态调控”——不仅能快速识别细胞代谢轨迹偏离并及时干预，还能在工艺放大或批次波动时迅速识别异常根源，从而显著提升批间一致性与产品收率，真正践行了PAT“质量源于设计”的核心理念。

但是在实际的生产过程中，相当多的客户面临一个难题：数据漂移。在线拉曼的数据发生漂移后，会严重影响模型在不同项目间的准确性和通用性。在线拉曼出现数据漂移的现象，关键原因之一在于模型的不适配。因此，构建一个稳健、通用且可适配生物反应器的拉曼模型，需要从实验设计、光谱预处理、建模策略的系统性地规划。

第一阶段：实验设计与数据采集

建模的首要准则：必须使用来自实际生物反应器基质的校正集样品。生物基质中数十种有机/无机成分产生的协同散射效应，无法通过简单的"查找-匹配"光谱库来规避。

操作流程 

01、在测试正常工艺参数的基础上，增加参数变化的组合，以获得更全面的图谱数据，提高模型通用性。例如，改变补料速率、pH、温度，使目标物（如葡萄糖、乳酸）的浓度范围比正常工艺拓宽30%~50%。

02、设定采集参数，以厂家推荐的参数为基础，如积分时间（通常1-10秒）、扫描次、分辨率。确保获取最佳光谱信号。

03、在线检测后的同时立刻采用，进行样本处理，使用相关离线设备如生化分析仪等检测相关指标。 

避坑指南 

• 样本必须具有代表性、普遍性

离线采样间隔必须具有代表性，不可只在某特定时间点取样，例如不可只在补料前后取样，导致光谱信息高度共线性。结果PLS模型利用的是“时间”相关性而非“化学”相关性，R²=0.99，但换个补料策略模型仍旧失效。

取样时刻与光谱采集时刻必须严格对应。在线拉曼是实时在线检测，如果反应器或取样管路中有死体积，样本滞后1-2分钟，那么以此建立的模型依然不可用。

• 数据覆盖全流程

数据必须覆盖接种初期、指数生长期、稳定期和衰退期，因为细胞浓度（散射）和背景荧光会剧烈变化，模型必须涵盖细胞生长的全流程数据，否则培养后期拉曼预测值必然发生漂移。

在生物反应器中进行在线拉曼检测、建模，和在其他场景下应用拉曼检测有一个本质区别。即生物反应器中物质种类繁多，有机质、无机盐种类近数十种，目标物质的拉曼特征信号会受到极大的背景干扰，并且其特征信号强度会受到结构相似物质信号的增强，进一步导致其信号失真。因此对拉曼建模过程中的光谱预处理和建模方法，提出了更高的要求。

第二阶段：光谱预处理

原始拉曼光谱受荧光背景、颗粒散射及电噪声干扰严重，呈杂乱折线形态。预处理的目标并非单纯追求校正集拟合优度，而是提升模型在复杂波动环境下的长期稳健性。

参考预处理方法如下（需根据细胞系、待测物质、反应器环境选择组合使用）

• 剔除异常光谱信号

检查并剔除那些由气泡、瞬间的搅拌波动或激光功率不稳引起的剧烈跳变或饱和的“坏谱”，这一步是保证数据质量的基础。

• 去噪与平滑

在保留光谱特征峰形状的同时，滤除由探测器和环境带来的高频随机噪声。最常用的是Savitzky-Golay（S-G）平滑，是一种移动窗口的平滑算法，能在滤除噪声的同时较好地保持峰的宽度和高度。也可使用卷积平滑等其他方法作为替代。

• 基线校正

这是关键的一步，用于移除由荧光效应或样品散射光引起的缓慢变化的宽背景信号。这种干扰会抬高光谱的“地基”，导致光谱呈现向右抬升的形状，淹没微弱的拉曼信号。

• 常用方法有：

a、导数法：对光谱求一阶或二阶导数，将平缓的荧光背景扣除，同时也能增强光谱的细节特征（峰位变尖）。

b、小波变换：将信号和背景在不同频率尺度上分离，从而更精细地扣除背景，尤其适用于背景变化复杂的情况。

c、多项式拟合：通过算法拟合出一个背景基线，然后从原始光谱中减去。

• 散射校正

生物反应器中的细胞和固体颗粒会对激光产生强烈的物理散射，导致光谱基线发生漂移和斜率变化。为了消除这种物理效应带来的影响，使光谱更纯粹地反映化学信息。可选择使用标准正态变量变换（SNV）和多元散射校正（MSC）来校正由颗粒大小和分布不同引起的光谱差异。

• 归一化

在连续的检测过程中，激光功率会发生微小波动、样品总浓度会出现差异，这会使光谱整体强度发生变化。因此需要对光谱进行归一化处理，使不同时间、不同批次获取的光谱具有可比性。

可采用向量归一化或者特定波段归一化，向量归一化是将整个光谱向量缩放到单位长度。而特定波段归一化是将光谱信号除以某个稳定区域的信号值。

• 波段选择

在建模前，只截取包含目标物质的光谱区域，去除不含有效信息的区域（如边缘噪声区）。这不仅能减少计算量，还能提高模型的稳健性。

其次，在拉曼建模中，预处理的首要目标并非追求最高的模型拟合度（R²），而是为了提升模型在变化环境下的稳健性和通用性。一个经过恰当预处理、能抵抗各种干扰的模型，远比一个在理想条件下表现完美但易受扰动的模型更有价值。

第三阶段：模型建立与验证

通过以上步骤，可以获得目标物质的较为干净的拉曼信号，主流方法是使用偏最小二乘法（PLS）对数据进行建模。

在使用模型获取预测值这一步时，用户通常使用惯性思维，使用“标准曲线法”。即：预先使用一套标准浓度梯度的目标物质溶液，进行拉曼检测，构建一套标准的拉曼图谱，然后将实测的拉曼模型与标准模数据型进行查找、匹配，进而获得反应器中目标物质的预测值。

这种“查找——匹配法”存在天然的局限性。

因此，在生物反应器中使用在线拉曼，稳健的建模的方法应该以数学方式为主导，利用微积分、线性代数、化学计量学等学科工具，对光谱信号进行科学处理，获得的模型不仅能根据图谱获取正确的浓度数值，反之亦能通过浓度数值，倒推出拉曼信号图谱。后续在面临工艺参数、反应体系变化时，仍能获得稳定、准确的浓度预测值。

模型建立完成后须经独立批次外部验证，验证集需涵盖工艺边界条件。

Akwa®R1原位在线拉曼分析仪

Akwa®R1是一款内置标准化通用模型、实时监测的原位在线拉曼分析仪。在线实时监测生物工艺过程中的关键工艺参数(CPP)与产品质量属性(CQA)，如葡萄糖，乳酸、活细胞密度、活率、谷氨酸、谷氨酰胺、氨、抗体浓度等。以实现实时反馈控制，从而支持客户在保障产品质量的前提下提升目的蛋白产率，助力生物制药企业降本增效，更高效、稳定地完成工艺开发及生产。Akwa®R1在线拉曼在取样、光学系统、建模方面拥有多项专利技术。

归根结底，在线拉曼设备仅是价值传递的载体，真正驱动其持续产出的核心，驱动其持续产出价值的是科学严谨的建模方法论与贯穿设备全生命周期的PAT管理意识。从而将PAT“质量源于设计”的理念落实到每一次精准的代谢调控与每一批稳定的产品交付之中。